Media, Isolasi bakteri

A. Latar Belakang
Dalam belajar mikrobiologi penting untuk mengamati mikroorganisme dalam keadaan hidup, karena itu di dalam laboratorium dibuat medium untuk mengkultur mikroorganisme. Medium sendiri merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat hara (nutrient) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme . Medium tersebut dapat berupa medium cair ataupun medium padat. Mikroorganisme akan tumbuh dengan baik dalam medium apabila medium tersebut memenuhi persyaratan, antara lain : medium harus mengandung semua nutrien yang mudah digunakan oleh mikroorganisme; medium harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan pertumbuhan mikroorganisme; medium tidak mengandung zat-zat yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme; dan medium harus steril sebelum digunakan, supaya mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik . Penggolongan jenis medium dapat dilakukan berdasarkan sifat kehetrotrofannya ( media hidup dan media mati), berdasarkan konsistensinya ( media padat, semi padat dan medium cair), serta berdasarkan fungsinya (medium selektif, medium diferensial, medium eksklusif, medium Esei, medium diperkaya/enriched dan medium khusus). Untuk mempermudah mempelajari jenis-jenis mikroorganisme maka diperlukan kultur murni dari jenis mikrobia yang akan dipelajari. Kultur murni adalah biakan yang hanya terdiri dari populasi mikrobia yang berasal dari jenis yang sama.
Di alam, pada umumnya mikrobia hidup sebagai populasi campuran. Sehingga akan sulit untuk mempelajari mikrobia terkait dengan morfologi, fisiologi dan serologi mikrobia. Oleh karenanya perlu dilakukan isolasi mikrobia dari lingkungannya. Isolasi atau kultivasi adalah suatu usaha untuk memindahkan mikrobia dari lingkungannya di alam dan menumbuhkan sebagai biakkan murni dalam medium buatan. Selain itu, pada umumnya mikrobia tumbuh dalam populasi campuran. Untuk mengidentifikasi suatu mikrobia, termasuk struktur morfologi dan fisiologi dapat dilakukan dengan metode kultivasi atau isolasi dari habitatnya. Isolasi merupakan suatu usaha untuk memindahkan mikrobia dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi dalam kultur murni essensial untuk mendeskripsikan bentuk dan mengklasifikasikan spesies baru serta untuk determinasi suatu agen penyebab penyakit. Ada beberapa teknik isolasi yang biasa dilakukan pada bakteri atau mikrobia uniseluler. Salah satu yang paling umum dilakukan adalah teknik plate culture. Teknik ini menggunakan cawan petri untuk menumbuhkan mikrobia dengan suatu medium (Salle, 1961).Teknik plate culture ini masih terbagi lagi menjadi teknik-teknik spesifik. yaitu. streak plate method yang dilakukan dengan cara menggores medium dengan bakteri, pour plate method yang dilakukan dengan cara mencampur bakteri pada agar yang masih cair kemudian menuangnya ke dalam cawan petri serta Terakhir surface plate method yaitu dengan menggosok bakteri di atas medium agar.
Karena objek kajian dari mikrobiologi berupa mikroorganisme yang memiliki ukuran sangat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang, maka dari itu perlu dipelajari teknik mikroskopi. Dengan mikroskop, dapat diperoleh perbesaran yang memungkinkan untuk melihat mikroorganisme. Dalam penggunaan mikroskop, pengetahuan tentang prosedur penggunaan mikroskop yang baik dan benar akan menentukan berhasil tidaknya pengamatan-pengamatan mikroskopis yang dilakukan (Waluyo, 2008). Penggunaan mikroskop penting untuk mengamati sifat morfologi dari mikroorganisme yang diteliti baik dalam ukuran individual maupun koloni. Sifat-sifat morfologi yang diamati secara individu meliputi ukuran dan bentuk sel, keberadaan dan karakteristik spora, flagella dan karakteristiknya, serta ada tidaknya kapsula. Sedangkan morfologi koloni meliputi ukuran, bentuk, warna koloni dan sifat-sifat lainnya yang menentukan.
Teknik pengamatan dengan pewarnaan bakteri (stained) adalah teknik yang paling umum digunakan untuk mengamati morfologi dan fisiologi sel bakteri. Keuntungan pengecatan antara lain adalah sel bakteri dapat jelas terlihat dan sel bakteri dapat dibedakan dengan spesies sel bakteri lainnya. Ada beberapa jenis pengecatan bakteri antara lain pengecatan sederhana, pengecatan gram, pengecatan Acid fast, dan pengecatan negatif. Pengecatan sederhana adalah tenik pengecatan yang menggunakan satu macam cat saja. Cat yang paling banyak digunakan adalah karbolfuhsin, methylenin blue dan kristal violet. Fungsi pengecatan sederhana adalah mewarnai bekteri untuk pengamatan morfologi dan fisiologi bakteri. Selain itu, pengecatan sederhana berfungsi membedakan bakteri mati dan bakteri yang masih hidup. Pengecatan gram merupakan salah satu contoh pengecatan differensial. Pengecatan gram berguna untuk identifikasi dan determinasi sel bakteri. Cat utama yang dipakai adalah violet kristal, larutan Iod sebagai mordan, alkohol sebagai peluntur, dan safranin sebagai cat penutup. Dengan pengecatan gram, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif apabila dicat gram akan berwarna ungu sedangkan gram negatif akan berwarna merah (Talaro&Talaro, 1999). Teknik pengecatan negatif merupakan pengecatan tidak langsung yaitu pewarnaan latar belakang spesimen. Pada pengecatan ini, cat yang digunakan adalah nigrosin. Teknik pengecatan Acid fast (tahan asam) merupakan prosedur pengecatan differensial yaitu menggunakan lebih dari satu macam cat. Dengan teknik ini, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri acid fast (tahan asam) dan bakteri non acid fast (tidak tahan asam).
Jamur merupakan kelompok organisme eukariotik. Jamur ada yang tergolong mikrobia dan ada juga yang tidak. Jamur yang tergolong mikrobia contohnya adalah Khamir dan Jamur benang / Molds. Khamir adalah jamur yang tumbuh dalam bentuk uniseluler dan biasanya memperbanyak diri dengan cara tunas. Jamur ini tersebar di alam, dapat ditemukan di tanah, debu, serta buah dan daun pada banyak tanaman. Nampak seperti permukaan buih atau sedimen tebal pada jus buah dan cairan saccharine lain (Salle, 1961).
Contoh jamur yang kedua adalah jamur benang atau molds. Molds adalah jamur berfilamen yang bersifat parasit dan berkembangbiak dengan spora seksual dan aseksual. Merupakan suatu kelompok heterogenitas yang besar dari suatu tumbuhan, seperti organisme yang membentuk subdivisi Thallophyta (Salle, 1961). Contoh molds adalah Rhizopus sp., Pinicillium sp., Aspergillus sp. dan Monilia sp.
Salah satu makhluk hidup yang memiliki daya reproduksi tinggi adalah Fungi. Fungi merupakan kelompok mikrobia eukariotik heterotrofik yang tersebar luas di alam dan bersifat saprofit. Pembagian fungi didasarkan atas sifat khas struktur dan cara reproduksinya, yaitu Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, dan Deutromyces (Soetarto et al., 2008) . Jamur yang tergolong mikrobia contohnya adalah Jamur benang dan Khamir / Molds . Jamur benang adalah fungi multiseluler yang membentuk pertumbuhan memanjang yang bercabang yang dikenal sebagai miselium. Filamen individual dari miselium dikenal sebagai hifa. Pada beberapa jamur benang, hifa merupakan silinder multinukleus yang kontinu tanpa adanya dinding melintang, hifa seperti ini dikenal sebagai hifa tidak bersekat (nonseptae hyphae). Pada beberapa jamur benang yang lain, hifa memiliki dinding melintang yang memisahkan mereka ke dalam sebuah rantai dari sel individual, ada yang memiliki satu nukleus, atau pada umumnya dengan dua nukleus. Hifa seperti ini dikenal dengan hifa bersekat (septae hyphae) (Sarles et al, 1956). Jamur benang dapat pula dibedakan berdasarkan alat perkembangbiakannya yaitu antara lain dengan spora konidia dan lain sebagainya (Clifton, 1957). Perbedaan dapat pula dengan bentuk sel atau bentuk dari benang (hifa) yang dibentuk oleh jamur tersebut. Hifa dari jamur benang dapat dibedakan atas hifa vegetatif, yaitu hifa yang tumbuh menjalar dan berfungsi untuk menyerap makanan dan hifa fertil yang berfungsi sebagai alat reproduksi dan tumbuh ke atas. Warna koloni (pigmen) yang dibentuk oleh jamur benang tersebut pun dapat pula digunakan untuk mengidentifikasi jenis jamur benang yang membentuknya . Contoh dari jamur benang antara lain Rhizopus sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Mucor sp dan Monilia sp. Khamir merupakan fungi uniseluler yang tidak membentuk percabangan multiseluler (miselium), kebanyakan khamir bereproduksi secara vegetatif dengan tunas (budding), tapi ada sedikit jenis yang bereproduksi melalui fusi sel (Sarles, 1956). Morfologi khamir dapat berupa spheroidal, aksoidal, bentuk sosis, bentuk umum atau silindris. Bentuk morfologi, cara reproduksi, dan karakteristik fermentasi dapat dijadikan sebagai dasar untuk klasifikasi khamir.
Bakteri merupakan mikrobia uniseluler yang termasuk dalam kelas Schizomycetes. Terdapat berbagai macam bentuk dari bakteri yaitu berbentuk bulat/kokus, batang/bacilus, dan spiral. Bakteri dibedakan berdasarkan responnya terhadap O2 menjadi 4 macam, yaitu bakteri aerob, anaerob, anaeorob fakultatif, dan mikroaerofilik. Bakteri aerob membutuhkan O2 untuk hidupnya dalam jumlah banyak. Bakteri anaerob dapat tumbuh tanpa ada O2. Bakteri anaerob fakultatif merupakan bakteri yang tumbuh dengan ada atau tidaknya O2. Sedangkan bakteri mikroaerofilik adalah bakteri yang tumbuh pada jumlah O2 yang sedikit. Di dalam medium cair, bakteri tumbuh di permukaan medium yang berhubungan langsung dengan udara bebas. Bakteri anaerob dalam medium cair tumbuh di dasar medium cair karena bakteri tidak membutuhkan O2 sedangkan di dasar medium tidak terdapat O2. Bakteri anaerob fakultatif anaerob terdapat di seluruh bagian medium, di permukaan, di tengah, dan di dasar medium karena bakteri dapat hidup dengan atau tanpa O2. Bakteri mikroaerofilik tumbuh di dekat permukaan medium karena bakteri hanya mengambil O2 dalam jumlah yang sedikit (Pelczar and Reid, 1958).



B. Tujuan
Acara praktikum ini bertujuan untuk :
1. Mempelajari cara pemakaian mikroskop yang benar untuk mengamati preparat mikrobia dengan berbagai perbesaran
2. Mempelajari cara pembuatan medium dasar sebagai tempat biakan bakteri
3. Mengisolasi bakteri untuk mendapatkan kultur murni dengan berbagi metode
4. Mengamati morfologi jamur benang, sel khamir serta sifat bakteri dengan berbagai
pengecatan

II. METODE
A. Alat dan bahan
Pada praktikum kali ini alat yang dipakai adalah mikroskop, tabung reaksi, cawan petri steril, jarum ose, jarum enten dan drigalsky. Sedangkan bahan yang digunkan yaitu alcohol, medium nutrient agar padat dan cair, pepton, indicator universal, bakteri Escherchia coli Bacillus subtili dan Rhizopus sp., Penicilium notatum, dan Aspergillus sp., Debaryomyces sp., Saccharomyces sp.
B. Cara Kerja
Mikroskopi
Bagian-bagian mikroskop diamati, kemudian dicatat fungsinya serta dipelajari prosedur penggunaan mikroskop.
Penyiapan media tumbuh
Sebanyak 15-20 gram agar-agar ditambahkan pada nutrient cair, penambahan dilakukan untuk setiap 1000ml medium cair. Campuran tersebut kemudian diaduk hingga merata lalu disterilkan dengan menggunakan otoklaf yang diatur pada tekanan 2 atm, temperature 1210C selama 5 menit. pH medium diatur terlebih dahulu sebelum ditambahkan agar. Untuk medium agar tegak dan miring, disiapkan dengan menggunakan tabung reaksi 10ml diisi dengan larutan medium tersebut. Untuk medium tegak, medium nutrient diisikan ke tabung reaksi sebanyak 10ml dan 5ml untuk medium miring. Setelah disterilisasi, tabung diletakkan miring dengan sudut kemiringan 300 terhadap bidang datar dan dibiarkan padat, sedangkan untuk medium nutrient agar tegak tetap diletakkan pada posisi tegak.

Mikroskopi sel bakteri, khamir, dan jamur benang
Pertama-tama lampu mikroskop dinyalakan, kemudian intensitas cahaya diatur dengan kondensor dan diagfragma sehingga sesuai dengan kondisi mata pengamat. Preparat diletakkan pada meja benda (preparat kapang dan bakteri), secara bergantian dengan perbesaran lemah. Pemutar focus diputar untuk mendapatkan bayangan atau fokus yang sesuai dengan mata pengamat (digunakan perbesaran kecil terlebih dahulu). Setelah bayangan yang didapat bagus dan terlihat jelas focus dapat diganti dengan perbesaran yang lebih besar atau yang diinginkan (400x untuk kapang dan khamir serta 1000x untuk bakteri) dan sesuaikan lagi fokusnya. Jika belum mendapat bagian preparat yang diinginkan, meja beda dapat digeser-geser dengan pengatur meja benda. Untuk pengamatan bakteri, sangat dianjurkan untuk memakai minyak imersi. Setelah mikroskop selesai dipakai, lampu mikroskop dimatikan dan kondensor serta diagfragma dikembalikan seperti pada posisi awal. Lensa obyektif diputar sampai pada lensa yang memiliki perbesaran terkecil. Preparat diambil dari meja benda. Meja benda diturunkan ke posisi awal. Untuk pemakaian minyak imersi, setelah pemakaian mikroskop, minyak imersi dibersihkan dengan menggunakan larutan xylol.
Teknik isolasi
1. Metode streak plate
Medium agar steril disiapkan dalam cawan petri, selanjutnya ose disterilkan dengan cara insinerasi ( diganggang). Kultur bakteri cair diambil menggunakan ose yang telah steril lalu ose digoreskan pada medium agar yang menghadap ke api supaya tetap aseptis. Goresan yang dibuat diusahakan tetap menyambung dan membentuk gradien goresan. Setelah itu, cawan petri ditutup , dibungkus serta siap untuk diinkubasi..
2. Metode pour plate
Kultur bakteri cair diencerkan terlebih dahulu. Kemudian medium agar yang masih cair disiapkan dan ditunggu hingga temperatur 50oC. Kultur cair dan medium agar cair dicampur dan digojog hingga homogen. Larutan selanjutnya dituang ke dalam cawan petri steril, dan cawan petri dibungkus kembali lalu dibiarkan dalam suhu kamar.
3. Metode surface plate
Medium agar steril dalam cawan petri disiapkan. Kultur bakteri cair diambil sebanyak 1 ml dengan pipet ukur dan propipet kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril. Kultur bakteri cair diratakan dengan menggunakan drygalski di atas permukaan medium agar. Cawan petri lalu dibungkus dengan kertas dan dibiarkan pada suhu kamar.